非放射性物質標記核酸探針的方法通常是通過在核酸分子中引入諸如半抗原、生物素等惰性小分子。這些小分子一般通過連接到dUTP等核苷三磷酸上。這種經修飾的核苷三磷酸再通過酶促反應摻入到探針中，例如用于隨機引物法標記長鏈探針或是通過末端轉移酶標記寡核苷酸的3′端。

 

        雜交后用與一種酶相連接的抗體（或者如果是生物素，則用鏈霉抗生物素蛋白streptavidin）來檢測，這些酶如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶是用來催化所檢測反應的?？墒褂玫陌肟乖芏?，zui常用的是地高辛、生物素與熒光素。本法比直接酶標法步驟更多，因為其中包括膜的封阻、抗體的結合及膜的洗滌等額外操作，但它可用在通過堿性磷酸酶催化底物二氧雜環烷（dioxetane）的高靈敏度化學發光檢測上，還能用于寡核苷酸探針上，即通過偶聯在探針上的辣根過氧化物酶催化的強化化學發光進行檢測，具有低本底與快速光輸出特點。

 

        熒光素作為半抗原用于核酸標記探針有以下優點：

        ①熒光素在雜交中很穩定，甚至在較高溫度下也是如此。
　?、跓晒馑睾塑杖姿峥稍贒NA聚合酶作用下摻入到探針中去。
　　③針對結合物中的熒光素部分可以制備高親和力的抗體。
　　④標記的探針不用純化，因為當使用適當的封阻劑時，這種探針與膜的親和力很低。
　?、菔褂帽鞠到y時被抗體識別的內源性物質干擾的機會很小，但在原位雜交中如使用生物素則有干擾。
　　⑥熒光素用作半抗原的zui后一個重要優點是，在雜交開始之前就可知道探針標記反應能否成功，即通過快速（20 min）透射測定法測定所發出的天然熒光。監測探針標記的進程與用β-計數器對32P標記的探針檢測相似。

 

        熒光素基因顯影系統（fluorecein gene image system, Amersham International, Bucks, UK）就是利用熒光素作為半抗原，通過堿性磷酸酶催化二氧雜環烷的化學發光反應進行檢測。通過大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段來催化的隨機引物標記反應使熒光素-11-dUTP摻入到DNA鏈中。

 

        在這個反應中，Klenow片段特別有效，所以標記過程可認為是一個凈合成過程。例如50 ng的探針經1 h合成后可行到300 ng的探針。標記的探針不經純化即可直接用于雜交試驗中（先進行變性處理）。雜交的嚴格性可通過雜交過程中鹽離子濃度或溫度的調節來控制，或/和通過嚴格性洗滌來控制。所推薦的探針濃度與ECL直接標記系統相同：目標DNA較少時使用10 ng/ml的濃度；目標DNA較多時使用2~5 ng/ml的濃度。

 

        如果在雜交階級中以及在隨后加入抗體結合物前的膜封阻步驟中使用的是固體封阻劑，就可能因封阻劑難溶而造成程度不等的背景。使用封阻劑濃縮液可保證試劑的一致性和低本底。對抗體結合物制備進行優化及使用抗熒光素的單克隆抗體可進一步降低本底，提高信噪比。